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EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS - Sistemas de Expresión - Vectores
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pCNB4-S2
pCNB4-S2 es un plásmido que alberga un trasposón mini-Tn5 Km diseñado para la integración estable del módulo de regulación del CASCADETM en el cromosoma de una amplia variedad de bacterias Gram negativas. pCNB4-S2 transfiere un elemento móvil que expresa xylS bajo el control del promotor Psal y su análogo de respuesta a salicilato, el regulador nahR. La transposición del módulo regulador del sistema CASCADETM de pCNB4-S2 depende de la expresión de un gen codificante de una transposasa presente en este plásmido, en una posición externa al elemento transponible, de manera que, al no poder replicarse pCNB4-S2 en la bacteria receptora, el elemento transponible permanece de manera estable en su punto de inserción en el cromosoma bacteriano.
| REF. | PRODUCTO | FORMATO |
| EV-3407 | pCNB4-S2 | 8 µg |
pCCD5
pCCD5 es un vector de 3,4 Kb y 20-40 copias, derivado de ColE1, utilizado para la clonación y la expresión de genes de proteínas en E. coli con el sistema CASCADETM. pCCD5 contiene el promotor Pm precedido de un terminador transcripcional y situado "corriente arriba" del sitio de clonación múltiple, que incluye una eficiente región de inicio de la traducción.
| REF. | PRODUCTO | FORMATO |
| EV-3408 | pCCD5 | 8 µg |
Vectores pALEXa, b y c
Los vectores pALEXa, b y c contienen el dominio 3´ del gen lytA (proteína C-LYTAG) de Streptococus pneumoniae entre el promotor Pm y el sitio de clonación múltiple. Estos vectores permiten la expresión de proteínas de fusión a C-LYTAG con el sistema CASCADETM.
El sitio de clonación múltiple de los pALEX contiene 7 sitios de restricción únicos: BamHI, Xhol, Sacl, BgIll, BstBI y HindIII. Éstos sitios están disponibles en las tres fases abiertas de lectura (pALEXa, pALEXb, pALEXc) para facilitar la fusión traduccional del gen de interés a la región codificante de C-LYTAG.
Los vectores pALEX contienen el marcador de selección bla, que confiere resistencia a ampicilina, e incluyen la secuencia codificante para un sitio de reconocimiento de la enteroquinasa que permite eliminar fácilmente el dominio de fusión C-LYTAG.
| REF. | PRODUCTO | FORMATO |
| EV-3240 | pALEX-a | 8 µg | EV-3241 | pALEX-b | 8 µg | EV-3242 | pALEX-c | 8 µg | EV-3413 | pALEX a, b & c | 8 µg/cada uno |
pALEX2-Ca
pALEX2-Ca es un nuevo vector de expresión CASCADETM para la producción de fusiones C-terminales a secuencias C-LYTAG.
El C-LYTAG permite un alto grado de purificación de proteínas usando soportes cromatográficos de bajo coste (la resina C-LYTRAP es 5 veces más barata que otras resinas comerciales). Este tag también proporciona mejoras en la solubilidad de proteínas recombinantes, comparado con el His-tag, y es compatible con la purificación de metaloproteínas.
Las principales ventajas de este sistema de expresión y purificación son:
- - Sus bajos niveles de expresión basal facilitan la clonación de proteínas tóxicas y la estabilidad de cepas recombinantes.
- - Las funciones del sistema CASCADETM no requieren de condiciones especiales del medio de cultivo.
- - Es activo a baja temperatura de crecimiento.
- - Mayor nivel de purificación que His-tag.
- - Bajo coste de consumibles principales (inductor, soporte…) que permite un escalado de producción a coste eficiente.
- - Compatibilidad con mini-Tn5 para la construcción de cepas estables.
El vector pALEX2-Ca deriva del nuevo vector pALEX1a y por tanto incluye la región de clonación múltiple de este plásmido, con dianas únicas para una gran variedad de enzimas de restricción diferentes (para más detalles, consultar el mapa del vector).
NOTAS: El sistema de purificación C-LYTAG se mantiene a temperatura ambiente. Para periodos más largos, mantener los componentes acorde a las directrices de la tabla adjunta.
* CASCADETM es marca comercial de Active Motif, Inc., Carlsbad. El sistema de expresión CASCADETM está patentado y licenciado por Active Motif, Inc. licencia comercial. Por favor, contáctenos si quieren más información sobre derechos de licencia.
Vectores pALEX1a, b y c
pALEX1a, b y c son vectores bacterianos para la expresión de proteínas con el sistema CASCADETM, que pueden ser utilizados en cepas especializadas de E. coli que porten el módulo regulador nahR/Psal::xylS inducible por salicilato, como REG-1 o REG-12.
Estos nuevos vectores, de alto número de copias y seleccionables por resistencia a ampicilina incorporan un promotor Pm mutante con menor actividad basal, permitiendo así un mayor control sobre la expresión. Entre otras características, pALEX1a, b y c incluyen una región de clonación múltiple con dianas únicas para 20 enzimas de restricción diferentes, que facilitan la inserción de cualquier secuencia codificante y su fusión traduccional en fase con un codón de inicio ATG situado a una distancia óptima de una secuencia de unión a ribosomas altamente eficiente (RBSII). La región de clonación múltiple incluye en su extremo 3´ tres codones de parada de la traducción, uno en cada fase de lectura, y seguida por dos secuencias terminadoras de la transcripción (t0 y T1).
Los elementos descritos configuran un módulo de expresión flanqueado por dianas para la enzima de restricción NotI, que permiten transferir fácilmente cualquier construcción realizada en estos plásmidos a los vectores de integración mediada por elementos transponibles pUTmini-Tn5 (Ver Sección de Clonación), para su inserción estable en el cromosoma bacteriano.
| REF. | PRODUCTO | FORMATO |
| EV-3439 | pALEX1 a | 8 µg |
| EV-3440 | pALEX1 b | 8 µg |
| EV-3441 | pALEX1 c | 8 µg |
| EV-3462 | pALEX1 a, b & c | 8 µg/cada uno |
Vectores pALEX2a, b y c
Los nuevos vectores pALEX2 permiten la expresión, bajo el sistema CASCADETM, de proteínas fusionadas en sus extremos amino a una versión reducida de C-LYTAG, denominada LYTAG, y su posterior purificación o inmovilización mediante el uso de soportes cromatográficos compatibles con la tecnología C-LYTAG. El nuevo tag (136 aminoácidos, 15.21 kD) incorpora una secuencia polipeptídica estructurada en hélice alfa que actúa como elemento espaciador entre el dominio de unión a colina y la proteína de interés, reduciendo la posible interferencia estructural entre ambas regiones y facilitando, si es necesaria, la separación del tag mediante digestión con enteroquinasa, al favorecer el acceso de esta endopeptidasa a su secuencia diana.
Los vectores pALEX2 están disponibles en 3 fases abiertas de lectura (pALEX2a, pALEX2b y pALEX2c). Los pALEX2 derivan respectivamente de los pALEX1 (pALEX1a, pALEX1b y pALEX1c) y por tanto incluyen sus regiones de clonación múltiple, además de una diana única para la enzima de corte romo PshAI, cuya secuencia solapa con la secuencia codificante de la diana de la enteroquinasa, posibilitando la fusión directa a esta última del polipéptido a expresar y su recuperación sin aminoácidos no deseados en su extremo amino, tras la digestión con la endopeptidasa. Los vectores pALEX2 incluyen el gen marcador de selección bla, que confiere resistencia a ampicilina.
El módulo de expresión se encuentra flanqueado por dianas para la enzima de restricción NotI, que permiten transferir fácilmente cualquier construcción realizada en estos plásmidos a los vectores de integración mediada por elementos transponibles pUT mini-Tn5 (Ver Sección de Clonación), para su inserción estable en el cromosoma bacteriano.
| REF. | PRODUCTO | FORMATO |
| EV-4643 | pALEX2 a | 8 µg |
| EV-4644 | pALEX2 b | 8 µg |
| EV-4645 | pALEX2 c | 8 µg |
| EV-4658 | pALEX2 a, b & c | 8 µg/cada uno |