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EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
La expresión y purificación de proteínas es un paso crucial en aquellos proyectos implicados en la investigación de las propiedades estructurales y funcionales de las proteínas. La calidad de la proteína purificada es un factor irrefutable. Biomedal ofrece uan serie de servicios integrados en expresión y purificación de proteínas, tanto en E. coli como en levaduras. Biomedal ha estado centrada, desde su fundación, en el desarrollo de nuevas tecnologías que aumenten la eficiencia de estos procesos y la calidad de la proteína obtenida.
Gracias a nuestra experiencia acumulada en este campo, nuestra tecnología, instalaciones y a un equipo humano altamente especializado, Biomedal ofrece un servicio orientado a las necesidades del cliente, flexible, con asesoramiento permanente durante todas las fases del proyecto y a un precio altamente competitivo.
Nuestra batería de servicios de expresión y purificación de proteínas se dividen en 3 fases, pudiendo el cliente iniciar su proyecto desde la primera a la última, o bien incorporarse a la fase que más le interese.
Expresión y Purificación de Proteínas en E. coli:
Test de Expresión y Purificación
Mediante este primer servicio de expresión y purificación el cliente obtiene toda la información necesaria sobre los datos relevantes para expresar y purificar su proteína, tales como nivel de expresión, solubilidad, rendimiento de la purificación, etc. Estos datos son imprescindibles para calcular el volumen de cultivo necesario para producir la cantidad deseada de proteína.
El servicio, como norma general, utiliza el sistema de expresión CASCADETM así como la purificación por cromatografía de afinidad utilizando los tags propios de Biomedal, LYTAG y C-LYTAG, ambos incluidos en los vectores de expresión del catálogo Biomedal y los reactivos asociados. Si el cliente dispone de una construcción con un sistema de expresión diferente y está interesado en analizar el rendimiento inicial de ésta, podemos ofertar este servicio adaptado a sus necesidades concretas.
Especificaciones del servicio:
El cliente aporta:
- Fragmento de ADN clonado en uno de los vectores del catálogo Biomedal. Biomedal le enviará el vector de su elección junto con los primers necesarios para su secuenciación de manera GRATUITA.
- Información disponible sobre la proteína diana relevante para el proyecto.
El servicio incluye:
- Transformación del plásmido con el inserto de ADN codificante de la proteína problema en la cepa E. coli REG-12.
- Cultivo en pequeño volumen e inducción con salicilato.
- Lisis con PROLYSE Protein Extraction Solution, de Biomedal, y obtención de la fracción soluble.
- Purificación con Spin-columns.
- Análisis de los resultados mediante SDS-PAGE y Coomassie.
- Análisis de los resultados por Western blot utilizando un anticuerpo anti-tag específico (*).
- Cuantificación de la proteína purificada.
- Elaboración de un informe técnico final, incluyendo fotografía de la SDS-PAGE resultante, conclusiones y recomendaciones.
Con la información obtenida del Test de Expresión y Purificación se obtienen datos tales como: nivel de expresión, solubilidad, rendimiento de la purificación, etc. Estos datos permiten diseñar una estrategia de purificación específica y calcular el volumen de cultivo necesario para obtener la cantidad de proteína heteróloga deseada. Además, estos mismos datos permiten definir el proceso de optimización más adecuado que permita incrementar el rendimiento, pureza, solubilidad, etc. de la proteína del cliente.
Servicios Complementarios:
- Servicio de Síntesis de Oligonucleótidos: diseño de primers específicos del inserto para su secuenciación.
- Servicio de Clonación Génica: clonación del fragmento de ADN del cliente en el vector elegido.
- Servicio de Secuenciación: secuenciación del plásmido con el inserto de ADN problema para verificar que el fragmento está correctamente clonado y la fase de lectura es la adecuada.
- Servicio de análisis por Western Blot: para aquellos casos en los que aún observándose proteína purificada en el gel SDS-PAGE, el cliente está interesado en obtener datos adicionales para diseñar la optimización.
| SERVICIO | CAT. NO. |
| Western Blot (*) | SE-3346 |
| Oligosíntesis | SE-4772 |
| Clonación génica | SE-3334 |
| Secuenciación | SE-3384 - SE-3391 |
| Ref. | Producto |
| SE-3338 | Test de Expresión y Purificación de Proteínas en E. coli |
(*) Servicio complementario realizado sólo si el cliente lo especifica; o para casos donde no se observe proteína purificada en el gel SDS-PAGE.
Servicio de Optimización
Biomedal, a través de este servicio, ofrece la posibilidad de optimizar diversos factores relativos a la expresión y purificación de proteínas, tales como: nivel de expresión, solubilidad, nivel de pureza, rendimiento de la purificación, etc.
Tanto los datos obtenidos en el análisis Western blot, realizado al producto anterior Test de Expresión y Purificación, como los datos aportados por el cliente, si se incorpora de novo a este servicio, son la base fundamental con la que se diseñará la estrategia de optimización apropiada.
Este servicio de optimización está compuesto de 4 módulos claramente diferenciados, diseñados para cubrir todas las necesidades del cliente y los diferentes escenarios que se pueden plantear según el tipo de proteína: cepas especializadas, condiciones de inducción, purificación a partir de cuerpos de inclusión y purificación específica.
(*) Servicio complementario realizado sólo si el cliente lo especifica; o para casos donde no se observe proteína purificada en el gel SDS-PAGE.
Optimización con Cepas Especializadas:
Este módulo está diseñado para corregir problemas de expresión relacionados con el metabolismo de las cepas hospedadoras. El servicio consiste en la realización de pruebas de expresión y purificación en dos cepas de E. coli modificadas genéticamente, alternativas a nuestra cepa estándar E. coli REG-12, que aportan dos ventajas claras para la expresión de proteínas:
- Mejor nivel de expresión para el caso de proteínas periplásmicas y/o de membrana.
- Optimización del sesgo de codones debidos a ADNc de origen no bacteriano.
El cliente recibirá en el informe técnico el grado de expresión y purificación obtenido con cada cepa especializada, facilitando su elección de la cepa a utilizar durante el escalado y previniendo las dificultades asociadas a la expresión de su proteína problema en E. coli.
Especificaciones:
El cliente aporta (*):
- Fragmento de ADN clonado en uno de los vectores del catálogo Biomedal. Biomedal le enviará el vector de su elección junto con los primers necesarios para su secuenciación de manera GRATUITA.
-- Secuencia de la construcción con el fragmento de ADN clonado.
El servicio ofrece:
- Transformación del plásmido con el inserto de ADN codificante de la proteína problema en dos cepas E. coli modificadas genéticamente, alternativas a nuestra cepa estándar E. coli REG-12.
- Dos cultivos paralelos (uno por cepa) en pequeño volumen e inducción con salicilato.
- Lisis con PROLYSE Protein Extraction Solution, de Biomedal, y obtención de la fracción soluble.
- Purificación con Spin-columns.
- Análisis de los resultados mediante SDS-PAGE y Coomassie.
- Análisis de los resultados por análisis Western blot utilizando un anticuerpo anti-tag específico.
- Cuantificación de la proteína purificada.
- Elaboración de informe técnico final, incluyendo fotografía de la SDS-PAGE resultante, conclusiones y recomendaciones para el proceso de obtención de la cantidad deseada de proteína.
(*) Estos requerimientos solo son necesarios si el cliente se incorpora a este servicio sin haber realizado previamente nuestro primer servicio de Test de Expresión y Purificación de Proteínas.
| Ref. | Producto |
| SE-4646 | Optimización con Cepas Especializadas |
Optimización de las Condiciones de Inducción:
Este módulo permite analizar diez condiciones de inducción diferentes para la expresión y purificación de la proteína problema. De esta forma, el cliente recibirá, a través del informe técnico, todos los resultados de expresión y purificación de los diferentes experimentos de inducción obtenidos con su proteína problema.
Especificaciones:
El cliente aporta (*):
- Fragmento de ADN clonado en uno de los vectores del catálogo Biomedal. Biomedal le enviará el vector de su elección junto con los primers necesarios para su secuenciación de manera GRATUITA.
- Secuencia de la construcción con el fragmento de ADN clonado.
El servicio ofrece:
- Diseño de la estrategia de optimización más adecuada a cada proteína específica.
- Transformación del plásmido con el inserto de ADN codificante de la proteína problema en la cepa E. coli REG-12.
- Cultivos en pequeño volumen con 10 condiciones de inducción diferentes.
- Lisis con PROLYSE Protein Extraction Solution, de Biomedal, y obtención de la fracción soluble.
- Purificación con Spin-columns.
- Análisis de los resultados mediante SDS-PAGE y Coomassie.
- Análisis de los resultados por Western blot utilizando un anticuerpo anti-tag específico.
- Cuantificación de la proteína purificada.
- Elaboración de informe técnico final, incluyendo fotografía de la SDS-PAGE resultante, conclusiones y recomendaciones para el proceso de obtención de la cantidad deseada de proteína.
(*) Estos requerimientos solo con necesarios si el cliente se incorpora a este servicio sin haber realizado previamente nuestro primer servicio de Test de Expresión y Purificación de Proteínas.
| Ref. | Producto |
| SE-4647 | Optimización de las Condiciones de Inducción |
Optimización por Purificación a partir de Cuerpos de Inclusión
Mediante la Optimización a partir de Cuerpos de Inclusión, Biomedal pone a punto el proceso de purificación de aquellas proteínas altamente insolubles y que forman cuerpos de inclusión. El cliente recibirá el protocolo más adecuado para dicha purificación en el informe técnico, conjuntamente al resultado cuantitativo obtenido.
Especificaciones:
El cliente aporta (*):
- Fragmento de ADN clonado en uno de los vectores del catálogo Biomedal. Biomedal le enviará el vector de su elección junto con los primers necesarios para su secuenciación de manera GRATUITA.
- Secuencia de la construcción con el fragmento de ADN clonado.
El servicio ofrece:
- Diseño de la estrategia de optimización más adecuada a cada proteína específica.
- Transformación del plásmido con el inserto de ADN codificante de la proteína problema en la cepa E. coli REG-12.
- Cultivos en pequeño volumen e inducción con salicilato.
- Lisis con PROLYSE Protein Extraction Solution, de Biomedal, obtención de la fracción soluble y solubilización de los cuerpos de inclusión**.
- Purificación con resina específica**.
- Análisis de los resultados mediante SDS-PAGE y Coomassie.
- Análisis de los resultados por Western blot utilizando un anticuerpo anti-tag específico.
- Cuantificación de la proteína purificada.
- Elaboración de informe técnico final, incluyendo fotografía de la SDS-PAGE resultante, conclusiones y recomendaciones para el proceso de obtención de la cantidad deseada de proteína.
(*) Estos requerimientos solo son necesarios si el cliente se incorpora a este servicio sin haber realizado previamente nuestro primer servicio de Test de Expresión y Purificación de Proteínas.
(**) Modificaciones del protocolo estándar según las características de cada proteína concreta.
| Ref. | Producto |
| SE-4648 | Optimización por Purificación a partir de Cuerpos de Inclusión |
Optimización por Purificación Específica:
Este último módulo de optimización es quizá el más abierto a las necesidades concretas del cliente en relación a aspectos concretos de la purificación, tales como purificación a un nivel de pureza determinado (Biomedal garantiza una pureza de entre el 80-90% en sus purificaciones estándar), purificación con técnicas alternativas a la cromatografía de afinidad, purificación por tag específico, etc.
Especificaciones:
El cliente aporta (*):
- Fragmento de ADN clonado en uno de los vectores del catálogo Biomedal. Biomedal le enviará el vector de su elección junto con los primers necesarios para su secuenciación de manera GRATUITA.
- Secuencia de la construcción con el fragmento de ADN clonado.
El servicio ofrece:
- Diseño de la estrategia de optimización más adecuada a cada proteína específica.
- Transformación del plásmido con el inserto de ADN codificante de la proteína problema en la cepa E. coli REG-12.
- Cultivos en pequeño volumen e inducción con salicilato.
- Lisis con PROLYSE Protein Extraction Solution, de Biomedal y obtención de la fracción soluble**.
- Purificación con resina específica**.
- Análisis de los resultados mediante SDS-PAGE y Coomassie.
- Análisis de los resultados por Western blot utilizando anticuerpo anti-tag específico.
- Cuantificación de la proteína purificada.
- Elaboración de informe técnico final, incluyendo fotografía de la SDS-PAGE resultante, conclusiones y recomendaciones para el proceso de obtención de la cantidad deseada de proteína.
(*) Estos requerimientos solo son necesarios si el cliente se incorpora a este servicio sin haber realizado previamente nuestro primer servicio de Test de Expresión y Purificación de Proteínas.
(**) Modificaciones del protocolo estándar según las características de cada proteína concreta.
| Ref. | Product |
| SE-4649 | Optimización por Purificación Específica |
Producción de Proteínas:
Los datos obtenidos en el primer servicio de Test de Expresión y Purificación permiten al cliente estimar el volumen de cultivo necesario para obtener la cantidad deseada de su proteína heteróloga. Si además, ésta se ha sometido a un proceso de optimización mediante alguno de nuestros módulos disponibles este volumen se verá probablemente reducido, así como las condiciones de purificación mejoradas, lo que permitirá obtener proteína con niveles superiores de calidad.
No obstante, aquellos clientes que dispongan de una construcción propia y datos sobre la cantidad de proteína purificada por volumen de cultivo, y quieran ahorrar tiempo y dinero, pueden contratar también nuestro Servicio de Producción de Proteínas para el volumen correspondiente a su cantidad deseada.
El servicio, como norma general, utiliza el sistema de expresión CASCADETM y la purificación por cromatografía de afinidad utilizando los tags propios de Biomedal, LYTAG y C-LYTAG. Tanto el sistema como los tags están incluidos en los vectores de expresión del catálogo Biomedal y los reactivos asociados. Si el cliente dispone de una construcción propia, ya sea con el sistema CASCADETM o con otro sistema diferente, podemos ofertar este servicio adaptado a sus necesidades concretas. De la misma forma, el método de purificación también es completamente adaptable a las características concretas de cada proteína.
Especificaciones del servicio:
El cliente aporta (*):
- Fragmento de ADN clonado en uno de los vectores del catálogo Biomedal. Biomedal le enviará el vector de su elección junto con los primers necesarios para su secuenciación de manera GRATUITA.
- Secuencia de la construcción con el fragmento de ADN diana clonado.
- Información disponible sobre la proteína diana relevante para el proyecto.
El servicio ofrece:
- Transformación del plásmido con el inserto de ADN codificante de la proteína problema.
- Cultivo en volumen especificado para la cantidad de proteína deseada.
- Lisis con PROLYSE Protein Extraction Solution, de Biomedal y obtención de la fracción soluble**.
- Purificación con resina específica**.
- Análisis de los resultados en geles SDS-PAGE.
- Proteína purificada (de forma estándar se proporciona a un nivel de pureza de entre 80-90%) en la cantidad solicitada por el cliente.
Servicios Complementarios:
- Servicio de Síntesis de Oligonucleótidos: diseño de primers específicos del inserto para su secuenciación.
- Servicios de Clonación Génica: clonación del fragmento de ADN del cliente en el vector elegido.
- Servicio de Secuenciación: secuenciación del plásmido con el inserto de ADN problema para verificar que el fragmento está correctamente clonado y la fase de lectura es la adecuada.
- Servicio de síntesis de Genes: diseño optimizado de su secuencia de ADN para optimizar la expresión de ésta.
- Servicio de separación del tag con endopeptidasa de corte específico: para aquellos estudios en los que la cola polipeptídica del tag interfiera con el uso posterior de la proteína.
| SERVICIO | CAT. NO. |
| Optimización por Cepas Especializadas | SE-4646 |
| Optimización de las Condiciones de Inducción | SE-4647 |
| Optimización por Purificación a partir de cuerpos de Inclusión | SE-4648 |
| Optimización por Purificación Específica | SE-4649 |
| Síntesis de Oligonucleótidos | SE-4772 |
| Clonación Génica | SE-3334 |
| Secuenciación | SE-3384 - SE-3391 |
| Síntesis de Genes | SE-3348 - SE-3350 |
| Separación del tag con endopeptidasa | SE-4651 |
(*) Estos requerimientos solo son necesarios si el cliente se incorpora a este servicio sin haber realizado previamente nuestro primer servicio de Test de Expresión y Purificación de Proteínas.
(**) Modificaciones del protocolo estándar según las características de cada proteína concreta.
| Ref. | Producto |
| SE-4652 | Producción de Proteínas en E. coli: 250 ml |
| SE-4653 | Producción de Proteínas en E. coli: 500 ml |
| SE-4654 | Producción de Proteínas en E. coli: 750 ml |
| SE-4655 | Producción de Proteínas en E. coli: 1 L |
| SE-4656 | Producción de Proteínas en E. coli: 1-3 L |
| SE-4670 | Expresión y Producción de Proteínas en E. coli + Western Blot |
Expresión y Purificación de Proteínas en Levaduras:
Expresión y Purificación en Saccharomyces cerevisiae:
La expresión de proteínas heterólogas en sistemas bacterianos es una forma eficaz de obtener altos rendimientos de nuestra proteína deseada a un bajo coste. En algunos casos, los sistemas de levaduras pueden ser una alternativa eficiente para expresar y purificar algunas de estas proteínas.
Siguiendo la idea del sistema CASCADETM bacteriano, Biomedal ha desarrollado, junto a científicos del Departamento de Genética de la Universidad de Sevilla, su propio sistema de expresión en levaduras, Y-CASCADE. La tecnología Y-CASCADE combina las caraterísticas y ventajas del bien conocido promotor GAL1 de S. cerevisiae con las ventajas del concepto CASCADETM.
Y-CASCADE permite expresar proteínas recombinantes en un sistema eucariótico con inductor de bajo coste y sin requerimientos de cambios en la formulación del medio durante la inducción de la levadura recombinante.
Además de la tecnología Y-CASCADE para S. cerevisiae, Biomedal, en colaboración con la Universidad Complutense de Madrid (España), ha desarrollado la tecnología EASYEAST para S. cerevisiae. La tecnología EASYEAST hace innecesario el uso de métodos químicos, enzimáticos o mecánicos para romper la pared celular. Las cepas EASYEAST tienen mutaciones que resultan en una fragilidad condicional de la pared celular. La principal ventaja de este sistema es que las proteínas intracelulares pueden ser liberadas fácil y eficientemente cultivando las células en medio de baja osmoticidad y temperatura moderada (37ºC).
Las tecnologías de expresión en S. cerevisiae de Biomedal así como la experiencia de nuestros técnicos nos permiten ofrecer una batería de servicios de expresión y purificación en este organismo, eficientes, personalizados, con asesoramiento en todas las fases del proyecto y a un precio muy competitivo.
La estructura de los servicios es la misma que para el caso de E. coli, dejando igualmente, la puerta abierta a las necesidades concretas del cliente.
| Ref. | Producto |
| SE-4671 | Test de Expresión y Purificación en S. cerevisiae |
| SE-4672 | Optimización en cepas EASYEAST |
| SE-4673 | Optimización de las Condiciones de Inducción |
| SE-4674 | Optimización por Purificación Específica |
Expresión y Purificación en Baculovirus:
La expresión y purificación en Baculovirus ofrece las ventajas que supone la expresión en un sistema eucariota con unos niveles elevados de expresión de genes recombinantes, así como un fácil escalado.
Como en los casos anteriores, el método de trabajo de los servicios de Biomedal, en expresión y purificación de proteínas en Baculovirus se divide en varios servicios principales:
| Ref. | Producto |
| SE-4880 | Clonaje en un vector de expresión en baculovirus (1 tag) |
| SE-4881 | Clonaje en dos vectores de expresión de baculovirus (2 tags diferentes) |
| SE-4882 | Generación de baculovirus recombinantes (1 tag) |
| SE-4883 | Generación de baculovirus recombinantes (2 tags diferentes) |
| SE-4806 | Espectrometría de masas MALDI-TOF |
| SE-4884 | Amplificación de baculovirus recombinantes para stock de título elevado |
| SE-4885 | Optimización de la expresión |
| SE-4886 | Producción a gran escala |
| SE-4887 | Purificación de la proteína recombinante soluble |
| SE-4888 | Purificación de proteínas fusionadas a His insolubles |
Expresión y Purificación en Mamíferos:
La expresión y purificación en Baculovirus ofrece niveles más elevados de procesamiento post-transduccional de las proteínas.
Como en los casos anteriores, el método de trabajo de los servicios de Biomedal, en expresión y purificación de proteínas en Mamíferos se divide en varios servicios principales:
| Ref. | Producto |
| SE-4803 | Clonaje en vectores de expresión de mamíferos |
| SE-4804 | Ensayo de expressión a pequeña escala (con linear PEI) |
| SE-4805 | Ensayo de expresión a pequeña escala (con lípidos catiónicos) |
| SE-4806 | Espectrometría de masas MALDI-TOF |
| SE-4807 | Revisión de resultados por el cliente (opcional) |
| SE-4808 | Producción a media escala (con linear PEI) |
| SE-4809 | Producción a media escala (con lípidos catiónicos) |
| SE-4810 | Purificación de la proteína recombinante soluble |
| SE-4811 | Purificación de proteínas fusionadas a His insoluble |
| SE-4812 | Elaboración de informe final detallado y envío de muestras |